**IVT(InVitroTranscription)**是mRNA生产工艺中的关键步骤。高效的IVT体系能够提高产量、减少物料消耗、降低生产成本,并确保mRNA分子的完整性、加帽率和双链RNA杂质等核心质量指标,从而简化下游纯化过程。在整个工艺流程中,IVT起着承上启下的作用。
IVT反应过程较为简单,标准的IVT体系主要由DNA模板、T7 RNA聚合酶(T7RNAP)、核苷三磷酸(NTPs)、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂及反应缓冲液等组成。DNA模板通常是PCR产物或线性化质粒,含有T7启动子、5’UTR、编码序列(CDS)、3’UTR和Poly(A)等基本组件。NTP则作为转录底物,可通过替换为修饰核苷酸来提升mRNA的稳定性和免疫原性等。无机焦磷酸酶的作用在于水解转录过程中产生的焦磷酸,从而提高反应效率,而RNase抑制剂则用于抑制可能存在的RNase污染。T7RNAP是整个反应体系中的核心酶,负责识别DNA模板并转录mRNA。
除了DNA模板质量,影响IVT反应效果的关键因素还包括T7RNAP和缓冲体系。T7RNAP特异性识别T7启动子,无需额外的蛋白或辅助因子即可完成转录,使其成为体外转录mRNA的最佳选择。T7RNAP具有典型的结构特征,类似于右手,包含N端结构域和C端结构域,其结构特征对其功能具有重要影响。
研究显示,IVT反应参数的选择对mRNA及saRNA的产量和质量有显著影响。例如,温度的变化会对长片段saRNA的完整度产生直接影响。随着温度从20℃提高到42℃,虽然saRNA的产量会增加,但其完整度在超过32℃时急剧下降。因此,优化低温转录的T7 RNA聚合酶或许是一个值得关注的方向。
瀚海新酶近期在高温条件下筛选了多种T7 RNA聚合酶突变体,包括耐热型和低双链RNA型,新的技术如荧光激活液滴分选技术(FADS)为突变体的筛选提供了高通量的方法。这些突变体表现出更高的热稳定性,能够在较高温度下有效提高circRNA的合成。同时,瀚海新酶还在持续优化T7RNAP的3’端一致性,以降低转录副产物的生成。
在IVT反应中,反应缓冲液的优化同样至关重要。缓冲液通常包含多种组分,如盐类、pH缓冲剂、二价阳离子和还原剂等。这些成分的浓度和比例对RNA聚合酶的活性、特异性及稳定性有直接影响,从而影响最终的RNA质量。针对不同参数的优化研究与应用,为提高mRNA的产量和质量提供了可靠的理论基础。
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