大多数致病遗传变异是由碱基点突变、插入或缺失突变引起的，因此，探索如何在活细胞内修复这些突变以恢复正常细胞功能，一直是生命科学的一个长期目标。近年来，一种不需双链断裂和供体模板的新型基因编辑工具——引导编辑（Prime Editing, PE）逐渐崭露头角。PE展现了纠正致病突变和插入保护性等位基因的巨大潜力。初代引导编辑的效率相对较低，David Liu团队对此进行了系统性改进，对pegRNA进行优化，并取得了良好效果。

在David Liu团队最新的研究中，通过优化双AAV载体系统，他们成功实现了小鼠脑、肝、心等多个器官的高效Prime编辑，为基因治疗提供了新的技术手段。接下来，让我们一同探讨v3emPE系统的功能表现。

v3emPE-AAV双载体系统设计

v3emPE引导编辑系统由向导RNA（epegRNAs）引导，由逆转录酶MMLV与nCas9构成的融合蛋白辅助，使其可实现目标位点碱基的精准编辑（替换、插入、删除）。此系统主要包含三个组分：epegRNAs、逆转录酶MMLV和nCas9。然而，MMLV与nCas9的编码蛋白序列长度约为63kb，超出了AAV载体的包装限制（47kb）。为了突破这一限制，v3emPE与分裂型内含肽（intein）结合，设计成双AAV载体系统：在nCas9的第1024位置拆分PE编码序列，分别与源自念珠藻的NpuDnaB快速剪接内含肽的两端融合，构建在两个AAV载体上。共转染这两个AAV后，内含肽通过自剪切作用重新组合成完整的PE蛋白，恢复编辑功能。

v3emPE-AAV双载体系统的改进

1. 启动子升级：使用强效启动子Cbh替代传统的EFS启动子，大幅提升PE蛋白的表达水平。

2. epegRNA稳定化：在传统peekRNA的3′端添加tevopreQ1修饰及8nt链接序列，显著提升了pegRNA的稳定性、编辑效率和特异性；相比传统pegRNA，这些优化后的epegRNA的编辑效率提高了15-40倍。

3. 编辑策略：使用高保真度的引导RNA（epegRNA）和单导向nicking sgRNA（sgRNA）来指导PE到目标DNA位点（sgRNA设计距离编辑位点40-90nt）。

v3emPE-AAV双载体系统的应用

PCSK9Q152H是被称为“天然保护突变”的基因，通过降低LDL-C水平显著减少冠状动脉疾病的风险，同时没有明显的不良反应，因而被视为“有益突变”。相关文献中，利用v3emPE-AAV双载体系统，成功在成年小鼠的肝脏中实现31%和38%的精准编辑；与未处理的小鼠相比，实验小鼠的总血浆胆固醇水平降低了20%，低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平降低了27%。这验证了优化的v3emPE3-AAV系统在体内具有强大的治疗相关原位编辑能力。

v3emPE3-AAV系统的生物安全性

该系统展现出良好的生物安全性：脱靶效应方面，使用CIRCLE-seq技术评估了10个潜在的脱靶位点，未发现显著的脱靶编辑，验证了Prime编辑的高特异性；毒性评估方面，血清转氨酶（ALT、AST）水平及肝组织病理切片均未见显著异常，表明v3emPE-AAV系统不会引起明显肝毒性。

作为新一代的精准基因编辑方法，PrimeEditor展示了其独特的创新性。根据客户的需求，人生就是博-尊龙凯时可以设计个性化的epegRNA和nicking sgRNA，以实现目标基因的编辑。如果您对此有兴趣，欢迎随时咨询！

参考文献：

1. Davis, J. R. et al. Efficient prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs. Nat Biotechnol (2023).
2. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019).
3. Davis, J. R. et al. Efficient in vivo prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs. Nature Biotechnology 42, 253-264 (2024).
4. Chen, P. J. et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell 184, 5635-5652 (2021).
5. Nelson, J. W. et al. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nature Biotechnology 40, 402-410 (2022).
6. Arboleda-Velasquez, J. F. et al. Resistance to autosomal dominant Alzheimer’s disease in an APOE3 Christchurch homozygote: a case report. Nature Medicine 25, 1680-1683 (2019).